快速现场评价（rapidonsiteevaluation，ROSE）技术历史悠久，但在过去相当长一段时间内并未得到广泛开展。由于各类介入与微创技术快速崛起，加之快速染色制片技术的进步，ROSE技术的价值与优势变得愈加凸显，正在临床中发挥越来越积极的作用。本文发表在《天津医药》年3月第42卷第3期，现整理如下，以飨读者。（冯靖，陈宝元，吴琦.应重视介入呼吸病学的快速现场评价[J].天津医药,42(3):-.）
1现代ROSE技术的起源和发展
年左右，经气管镜针吸活检（TBNA）、经气管镜细针吸引细胞学检查（FNA）与针吸脱落细胞学检查等介入呼吸病学技术大量开展。这些检查具备良好的敏感性和特异性，不仅广泛用于呼吸系统恶性疾病的诊断，在如结节病、肺结核等良性呼吸系统疾病的诊断中也有较大临床意义。如果通过这些检查能够得到合适的标本，则无需进行如纵膈镜、电视辅助胸腔镜以及开胸活检等创伤性较大的检查[1]。但在这些检查中，如何判断是否得到了标本，得到的标本量是否足够和合适，标本如何进一步处理，甚至如何立即获得初步诊断等问题就摆在了介入呼吸病学专家面前。显然，这些实时的信息其作用是不可估量的。实际操作中，如果得到了合适标本，操作即应立即终止，不仅节省时间而且减少患者创伤和并发症的发生。相反，如果没能得到标本，操作应继续进行并同时改变操作的方式方法。而且，如能立即获得初步诊断，不仅为临床医师提供重要参考，还可以做进一步操作和适当处理，以帮助进行特殊辅助检查如电子显微镜、免疫组织化学、染色体荧光原位杂交（FISH）、聚合酶链反应（PCR）以及微生物学相关检查，从而使得整个操作近乎完美。正因如此，各种类型的ROSE技术在欧美得以广泛使用[2-3]。由于ROSE技术（本文中特指呼吸ROSE技术）具有出结果极快和可重复次数极高的优势，使得其在介入呼吸病学和呼吸危重症的治疗方面具有较大的临床意义。
有关现代ROSE的系统研究和系统meta分析始于年，Austin等[4]对55例怀疑患有肺癌的患者进行了细针穿刺针吸活检，结果有ROSE指导的操作其阳性率为%，而没有ROSE指导的操作其阳性率仅有80%，该研究证实ROSE可以提高手术操作的阳性率并减少无谓的手术操作，从而能减少操作相关并发症[4]。
近年来，介入呼吸病学快速发展，一批新技术应用于临床。主要包括：X线定位支气管镜技术、经支气管镜超声技术、电子导航超细支气管镜技术、电磁导航支气管镜技术、三维仿真支气管镜技术等，加之肺部外科手术技术的进步以及呼吸危重症治疗中对微生物病原学的急切要求，对ROSE技术提出了许多更高的要求。
2ROSE技术的分类和临床价值
ROSE工作者可以是有专门经验的病理学专家，也可以是呼吸介入中心的技术人员、护士、实习研究生，甚至是直接参与介入操作的临床医师。呼吸ROSE技术主要包括两大部分：快速现场细胞学评价（CytologicalROSE，C-ROSE）和快速现场微生物学评价（MicrobiologicalROSE，M-ROSE）。这两部分缺一不可，相辅相成，构成了呼吸ROSE技术的完整轮廓。
C-ROSE的主要临床意义包括：（1）指导介入呼吸病学诊断的进度。如指导经气管镜黏膜活检、经气管镜深部肺活检（TBLB）、经气管镜深部刷检、TBNA、FNA、经气管镜支气管肺泡灌洗（BALF）、经皮肺活检、经皮胸膜活检、经胸腔镜胸膜活检，以及其他部位（如皮下或深在部位）针吸脱落细胞学检查。（2）指导介入呼吸病学治疗的进度与判断介入呼吸病学治疗的效果。如指导各类经气管镜消融治疗（高频电刀、氩等离子电凝、冷冻切除、光动力治疗、经气管镜微波治疗、经气管镜激光治疗等）。（3）经气管镜确定肺部肿瘤外科手术切除线。（4）指导中心性肺癌患者的诊断及治疗后随访。M-ROSE的主要临床意义包括：（1）可以提供部分微生物病原的形态学依据。如念珠菌属的属间鉴别、曲霉菌属的属间鉴别、耶氏肺孢子菌、其他类型的真菌、球菌和杆菌的形态学、中性粒细胞球菌和杆菌的细菌吞噬现象。（2）可以有极高的重复检查次数。（3）由于可以提供细胞分类与计数及其比例等细胞学背景，因此可以进行病情的估计和疗效的预判。
3ROSE技术的基本操作方式
ROSE在实际操作中主要是用普通光学显微镜或荧光显微镜对于采集到标本的玻片进行立即观察判读并获得结果。所以，ROSE操作实际上由制片、染色和观察3部分构成。由于对时间的严格要求，ROSE操作的核心是如何提高制片和染色的速度。ROSE快速制片方式主要有：（1）小外检组织块滚片（印片）法：用于多数经气管镜或胸腔镜黏膜活检与肺活检，经皮肺活检或其他经皮检到的组织块，还用于TBNA到的条形组织块。（2）细胞刷涂抹（刷片）法：用于多数经气管镜刷片或用于其他较黏稠样品。（3）喷片法与喷射推片法：用于多数FNA，也用于经皮细针吸引肺细胞学活检或其他经皮检到的细胞学标本，还用于TBNA到的条形组织块以外的细胞学标本。（4）液基薄层细胞制片（TCT）法：用于液基标本，如胸水或TBNA、FNA获得的液基标本。（5）微孔滤膜过滤法：也用于液基标本。（6）涂抹法：用于痰液等黏稠的液体标本。
对于做好的ROSE制片，应根据患者实际情况适当采用以下方式进行快速染色：（1）极快速（30s）改良瑞氏染色（Wright’sstainmodifiedbyFeng,WF染色）：它是在瑞氏染色基础上加以改良所形成的一种极快速染色方式，耗时仅仅30s，多数情况下1min内就可以在显微镜下观察。这种染色通用于绝大多数C-ROSE与M-ROSE，简单、快速、直接、有效，是ROSE最常用的染色方式。通常，单做WFROSE在大多数情况下就已经足够了。而对于不熟悉WFROSE的呼吸介入中心，也可以直接采用瑞氏染色或瑞氏-吉姆萨染色，同样能在数分钟内完成。瑞氏和改良瑞氏染色主要由A液浸泡、磷酸盐缓冲液浸泡、B液浸泡和清水清洗4步构成，然后立即用吸水纸吸干，上普通光学显微镜观察。（2）极快速（10s）改良乳酸染色：也叫改良乳酸酚棉兰染色。这种染色主要应用于各类真菌。（3）快速（30min）支原体DNA霍氏荧光染色：这种染色耗时30min，主要应用于支原体感染。（4）快速（20min）金-罗耐酸菌荧光染色：也叫金胺O-罗丹明荧光染色，主要应用于抗酸菌如结核分枝杆菌和努卡菌，也用于军团菌。通常结核分枝杆菌和努卡菌为金胺O-罗丹明染色强阳性，而军团菌染色可呈弱阳性。（5）试剂盒化快速（3min）革兰氏染色：这种染色主要应用于球菌和杆菌。根据笔者的经验，WF染色完全可以实现革兰染色的功能。
4现代C-ROSE在临床的应用情况
近些年来，C-ROSE在介入呼吸病学新技术应用中发挥了不可低估的作用。Loo等[5]将ROSE应用于电磁导航支气管镜（ENB），他将ROSE与正电子发射计算机断层扫描（PET-CT）、ENB钳检和ENB刷检结合起来用于对约2cm的外周肺结节进行检查。结果显示ROSE可明显提高诊断率，使总体诊断率达94%，且无任何操作相关并发症的产生。在另一些研究中，ROSE技术被应用于ENB和荧光导航支气管镜技术中，也明显提高了诊断率并减少了操作相关并发症的发生[6-7]。经支气管镜超声技术也是近几年的一项新兴技术。Collins等[8]将ROSE与该技术联合应用进行TBNA，结果显示同不使用ROSE相比，ROSE可减少33%的无谓穿刺和30%的无谓涂片，有68%的患者由于使用了ROSE技术，使得TBNA一次穿刺即获得成功。类似的结果也见于其他一些使用ROSE的超声支气管镜检查中[9-10]。
最近也出现了一批高科技C-ROSE技术，例如具有“一站式快速诊断”之称的波谱库ROSE技术，可将玻片与波谱库进行快速对比，从而立即获得诊断。这些诊断不仅限于恶性肿瘤，对于良性疾病和微生物病原也有快速诊断能力[11]。也有C-ROSE工作者将远程实时通讯技术应用于ROSE，使得一些ROSE水平欠发达的中心在介入呼吸病学操作中得到ROSE专家的指导[12]。
5现代M-ROSE在临床的应用情况
M-ROSE在欧美历史悠久，但真正大规模临床应用是近几年才开始的，尤其是众多呼吸重症监护病房（ICU）建立起来后，如何获得真正的感染致病原是困扰呼吸科与感染科医生的一大问题。痰培养的临床意义日趋受到弱化，呼吸ICU往往需要通过气管镜来采集真正意义上含有感染源的标本。介入呼吸病学采集感染源标本一般通过刷检和BALF两种方式进行。近年来，我中心（医院呼吸科气管镜介入中心）通过TBLB采集肺组织进行微生物病原学检查也取得了不错的成效。肺活检不像刷检，它可以采集深部肺泡组织及其衬液，对于鉴别定植菌和侵袭性感染菌有一定临床价值。但由于肺活检采集到的标本小，菌落又通常不暴露于组织块表面，需要将标本在培养皿上反复翻滚移动来进行细菌学种植培养。
由于苛养菌感染的日趋增加与定植菌的广泛存在严重干扰了细菌培养的可信度，临床医生对于细菌培养越来越不看重。即使细菌培养来自于BALF，临床医生通常也仅仅将其作为参考。M-ROSE的真正优势体现在微生物形态学和中性粒细胞、巨噬细胞或淋巴细胞吞噬细菌这两大方面，更为重要的是，它可以提供明确的细胞学背景。很显然，感染性疾病的细胞学背景如坏死、中性粒细胞与淋巴细胞的大量浸润与非感染性疾病如哮喘的嗜酸性粒细胞为主的细胞学背景存在明显差异，而慢性支气管炎的杯状细胞大量增生提示患者气道的高分泌性。再如，紧密存在的上皮样细胞和部分淋巴细胞提示肉芽肿性疾病的反应性增生，而不提示其他球菌、杆菌和真菌的感染。如果在此基础上，细菌实验室能够提示阳性抗酸染色结果，或者ROSE中金胺O-罗丹明荧光染色阳性，则能够确认结核病的诊断。而对于巨细胞病毒感染，细胞学背景在大多数情况下显得十分明显[13]。当然，如果能将M-ROSE形态学与其他更先进的微生物学方法如PCR、免疫荧光染色、流式细胞术、基因序列分析等相互结合，则能进一步提高M-ROSE的敏感性与特异性[14]。
在形态学方面，M-ROSE具备天然优势。如果再将TBNA广泛用于感染性疾病，就可以将TBNA和M-ROSE的作用同时发挥到极致，因为淋巴结尤其是隆突下淋巴结，是肺内各种病原的“天然收集器”，这一点在我中心的工作中已经得到了确认。M-ROSE对于真菌（尤其是处于菌丝时相的真菌）的确认相对容易，而且具有极高的灵敏度与特异性。这些容易确认的真菌包括隐球菌、芽生菌、组织胞浆菌、青霉菌和耶氏肺孢子菌，此外对于一些寄生虫如疟原虫、利什曼虫和刚地弓形虫，M-ROSE也能较快得到诊断[13]。结合几种M-ROSE方法，尤其是结合金胺O-罗丹明荧光染色法以后，对于结核也有很高的检出率。
中性粒细胞和肺泡巨噬细胞是机体对抗肺部细菌感染的主要防御机制。中性粒细胞、巨噬细胞或淋巴细胞吞噬细菌现象对感染性疾病的微生物病原有明确的提示意义。而当患者罹患血液系统疾病、免疫缺陷性疾病或处于免疫抑制药物治疗中时，吞噬细菌现象将会明显受到抑制。中性粒细胞介导的吞噬功能分为趋化（吞噬细胞向炎症部位迁移）、吞噬细胞表面颗粒黏附、吞噬和呼吸爆发以及氧依赖机制这几步，最后完成细菌细胞内死亡[15]。采用BALF快速TCT制片结合WFM-ROSE在中性粒细胞和肺泡巨噬细胞吞噬细菌方面可以获得较高的阳性率，我中心在此方面做了大量的工作，取得了不错的阳性率和符合率。
6如何卓有成效地开展ROSE工作
尽管ROSE技术有较多优点，但在很多介入中心，该技术尚未得到广泛开展。常常因为以下原因：（1）在很多医疗中心，即使是在病理科，也缺少专门致力于快速细胞学评价的专家，病理学家一般对组织病理学更热衷，在时间和精力上更愿意投入。即使有，这些细胞学专家也不愿意放下日常工作，将大量时间投入到介入呼吸病中心来。（2）缺乏经验。介入中心的医生与技术人员由于在病理学与微生物学方面经验欠缺，做ROSE工作时候不知如何入手。（3）缺少必要的热情。由于在最初的ROSE工作中没能得到良好的效果，认为ROSE临床意义不足，从而放弃在这方面再继续做工作。（4）认为耽误介入操作的进度。这往往是由于ROSE开展的不够好和不够成熟，制片与快速染色时间过长导致。（5）人力、财力及物力上的成本不能保证。
我中心每年平均开展ROSE约例，在C-ROSE和M-ROSE方面都取得了不少心得。目前我中心在C-ROSE方面与术后组织病理学的符合率将近%，在结核病方面约70%，在真菌等M-ROSE方面临床符合率也能超过90%。图1～8为我中心开展ROSE工作以来所拍摄的典型ROSE图片，分别为在痰涂片、胸水TCT、BALF、TBLB、TBNA、胸腔镜、中性粒细胞吞噬细菌和TBLB真菌形态学方面的应用情况。更欣慰的是，笔者发现在WFROSE制片的基础上，可以直接进行染色体荧光原位杂交（FISH）的操作。通过普通光学显微镜与荧光显微镜的实时游标照片对比，可以避免传统细胞学FISH的缺陷，真正实现了细胞学FISH的科学性，见图9。作为ROSE工作者，应该具备如下能力：（1）要全身心地投入，对ROSE制片要能认、敢认、认对。（2）还要有庞杂的交叉学科知识，ROSE涉及常规呼吸病学、肿瘤学、介入呼吸病学、病理学、细胞学、临床微生物学等多学科的综合知识。（3）分析ROSE结果的时候还要有严密的临床专科逻辑整合能力。应当结合病史、查体、影像学、实验室检查等等综合分析，做出正确判断。这就决定了呼吸科介入中心医师自己进行ROSE工作不可替代的天然优势。这些医生自己问病史、自己查体、会看CT、结合临床化验，再自己取标本，判读ROSE结果的时候一切心中有数，甚至能够预判。在长期的ROSE工作中，ROSE工作者要积累丰富的经验，不断提高临床素养。希望更多的介入中心将更多的时间和精力投入到ROSE中来，使得ROSE这朵“玫瑰花”芬芳绽放，春色满园。
参考文献
[1]GaspariniS.ItistimeforthisROSEtoflower[J].Respiration，，72(2):-.
[2]TrisoliniR,CancellieriA,TinelliC,etal.Rapidon-siteevaluationoftransbronchialaspiratesinthediagnosisofhilarandmediastinaladenopathy:arandomizedtrial[J].Chest，，(2):-.doi:10./chest.10-.
[3]DiaconAH,KoegelenbergCF,SchubertP，etal.Rapidon-siteevaluationoftransbronchialaspirates:randomised常见白癜风的治疗方法专门治疗白癜风的医院
