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接上文-非小细胞肺癌免疫组化指标及其鉴别（详讲一）

1.肺腺癌和鳞癌的鉴别诊断：a.TTF-1、NapsinA、CK5/6和p63(p40)是目前鉴别肺腺癌和鳞癌最常用的抗体组合之一。鉴于p63在10%-33%的肺腺癌中呈局灶性低表达，因此在判断p63染色结果时，仅弥漫性强表达于胞核时才能判读为阳性。同样，对于CK5/6，只有弥漫强表达时才能判断为阳性（弥漫性表达定义为50%的肿瘤细胞表达）。b.通常TTF-1/p63组合在腺癌和鳞癌均是一个阳性而另一个阴性，如果TTF-1/p63均阳性，倾向于诊断腺癌，因为p63可以在腺癌中表达而TTF-1几乎不在鳞癌中弥漫表达；如果TTF-1/p63均阴性，则仍然怀疑腺癌，因为TTF-1在差分化腺癌中缺失表达的现象较为常见，而p63在鳞癌中的表达非常稳定，一些所谓（p63阴性的低分化鳞癌）其实可能是实体腺癌；但TTF-1/p63双阴性也可见于其他类型腺癌。c.所有鳞癌标志物均不能鉴别转移性鳞癌，上皮癌甚至包括肉瘤和大细胞淋巴瘤（p63可在部分间变性大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤等中表达阳性），而p40在上述大细胞淋巴瘤中不表达，因此选择p40代替p63能有效避免将肺或纵隔的大细胞淋巴瘤误诊为鳞癌（表2）。d.鳞癌可能来自食管、头颈部，皮肤等部位，其他还包括膀胱等泌尿系统的尿路上皮癌。目前尚无有效的标志物（组合）将肺原发性鳞癌与转移性鳞癌鉴别。e.腺癌可能来自胃肠道，乳腺、卵巢、子宫内膜和前列腺等器官，未知原发部位的转移性腺癌占所有肺癌的3%-5%.一些腺癌转移至肺脏时仍然表达“器官特异性”的标志物，借助有效的抗体组合可以进行鉴别诊断。

表2：

标志物

应用

腺癌

TTF-1

非常有用，70%-80%腺癌表达，但仅70%的低分化实体性腺癌表达；约3%鳞癌呈灶性表达

NapsinA

非常有用，70%-90%腺癌表达，3%鳞癌表达

CK7

有用，几乎%的肺腺癌表达，30%-60%的肺鳞癌表达

SP-A/B

作用有限，约50%的肺腺癌表达，但差分化腺癌几乎不表达，鳞癌不表达

Cam5.2

作用有限，几乎%的肺腺癌表达，约35%的肺鳞癌表达

鳞癌

CK5/6

非常有用，75%-%的肺鳞癌表达，2%-20%的肺腺癌表达

p40

非常有用，95%鳞癌强烈表达，约3%的腺癌呈局灶性表达

p63

非常有用，90%肺鳞癌强烈核表达，约10%的腺癌呈局灶性低表达

DSG3

非常有用，85%-90%鳞癌表达，2%的腺癌表达

CK(34βE12)

无用，几乎%的肺鳞癌表达，但高达89%的腺癌也表达

2.肺腺癌与硬化性肺细胞癌的鉴别诊断

硬化性肺细胞癌由两型细胞组成：表面细胞和上皮圆形细胞，两型细胞均可能起源于呼吸道多潜能原始上皮细胞，具有II型肺泡上皮的分化特征，因此表达II型肺泡上皮细胞的免疫标志物，如TTF-1/NapsinA等。

但与肺腺癌弥漫一致性表达上述指标有所不同，硬化性肺细胞瘤两型细胞之间的表达模式有明显的特征。90%-%的硬化性肺细胞瘤两型细胞均表达TTF-1,但与表面细胞比较，圆细胞的染色强度稍弱。表面细胞弥漫一致性表达NapsinA,CK-pan、CK7和肺泡表面糖蛋白，大部分表达Cam5.2;而圆细胞不表达CKpan和肺泡表面糖蛋白，不表达或仅呈局灶性弱表达NapsinA,仅31%的病例表达CK7,17%的病例表达Cam5.2。除此之处，圆细胞通常一致性表达vimentin。需要注意的是，上述指标的表达模式只有在手术切除标本中才能充分显现，对于小活检标本，免疫标志物对于鉴别硬化性肺细胞瘤和低级别腺癌非常困难。3.肺原发性癌与转移性肿瘤的鉴别诊断

（1）肺腺癌与转移性腺癌的鉴别诊断

肺是多种类型癌转移最常见的部位之一，其中腺癌可能来自胃肠道、乳腺、卵巢、子宫内膜和前列腺等器官，未知原发部位的转移性腺癌占所有肺癌的3%-5%鳞癌可能来自食管、头颈部、皮肤等部位，其他还包括膀胱等泌尿系统的尿路上皮癌。目前尚无有效的标志物（组合）将肺原发性鳞癌与转移性鳞癌鉴别开来。一些腺癌转移至肺脏时仍然表达器官特异性的标志物，借助有效的抗体组合可以进行鉴别诊断。

肺腺癌常常需要与转移性结直肠腺癌鉴别，对于大部分肺腺癌，特别是具有II型肺泡上皮细胞/Calar细胞特征的腺癌，利用肺腺癌特异性的标志物如CK7、TTF-1和NapsinA,以及肠癌特异性标志物如CK20、CDX2等易与转移性结直肠癌鉴别诊断。但部分肺腺癌可表达（肠型）标志物（CK20,CDX20）,其中约8%的肺腺癌表达CK20,12%的肺腺癌表达CDX2。这类腺癌的主要特征是产生细胞内/外黏液，组织学类型包括黏液腺癌（黏液性BAC）、胶样腺癌、肠型腺癌以及部分腺泡/筛状为主型腺癌，如50%-90%的黏液腺癌表达CK20,且常常伴CDX2的表达。形态学上该类腺癌具有结直肠的鉴别诊断具有挑战性。除了常规应用免疫标志物组合以外，应综合病史，临床表现以及内镜和影像学资料进行考虑，以下表面支持泌黏液性肺腺癌的诊断：a临床以肺癌为首发症状，无结直肠癌病史及相关临床表现；b内镜和影像学检查除外结直肠肿瘤；c组织学除了肠型腺癌的特征外，还具有经典肺型腺癌的成分如贴壁生长，乳头或腺泡成分；d表达肺型标记如CK7/TTF-1或NapsinA等。除了结直肠腺癌外，转移至肺的腺癌还可能来源于乳腺、肾脏、卵巢、前列腺等远位器官，乳腺癌大部分表达ER/PR、GATA-3、GCDFP-15或乳腺球蛋白。GATA-3是乳腺癌的特异性标志物，在47%-%的乳腺癌中表达，其中90%以上的腺腔型乳腺癌表达GATA-3，但在三阴性乳腺癌中的阳性率罗低（40%）。肺腺癌不表达GATA-3，但部分东亚裔肺腺癌表达ER，因此，鉴别诊断时需结合TTF-1和NapsinA.肺腺癌不表达Pax-8,因此Pax-8表达强烈支持为转移性腺癌。RCC强烈表达Pax-8，结合Pax-2及其标志物有助于诊断RCC；Pax-8、ER和PR表达则支持卵巢浆液性腺癌的诊断；Pax-8、TG表达有助于甲状腺癌的诊断；PAS和PASP表达则强烈支持前列腺癌的诊断。（2）肺癌与胸膜上皮样恶性间皮瘤的鉴别诊断

肺腺癌与鳞癌有时需与胸膜上皮样恶性间皮瘤鉴别，特别是对于胸腔镜取样的小活检标本和胸水脱落细胞学标本。胸膜上皮样恶性间皮瘤与肺腺癌以及鳞癌鉴别诊断的常用免疫标志物（见表3，4）

目前尚无%的特异性标志物，因此就至少选择2个间皮和2个上皮标志物。根据抗体的敏感度和特异度，间皮瘤最好的标记为钙视网膜蛋白（Calretinin）、CK5或CK5/6、WT-1和D2-40，肺腺癌最特异性的标志物是TTF-1和NapsinA,p63/p40、DSG3是肺鳞癌的特异性标志物，p63和WT-1组合常用于上皮样间皮瘤和鳞癌的鉴别，其中p63在鳞癌中呈弥漫一致的强表达，而在间皮瘤中不表达；WT-1在绝大多数上皮样间皮瘤中表达，而在鳞癌中不表达。其他肺癌标志物，如MOC-31、Ber-EP4、CEA、BG8也常用于鉴别胸膜上皮样间皮瘤。Calretinin在几乎所有的上皮样恶性间皮瘤中呈胞核和质弥漫一致性强表达，但其在约40%的肺鳞癌通过呈局灶性表达，因此对于二者的鉴别诊断作用非常有限。表3：肺腺癌与胸膜上皮样恶性间皮瘤鉴别诊断的免疫组化标志物

标志物

应用

上皮样间皮瘤

Calretinin

非常有用，几乎所有的上皮样间皮瘤都表达，通常呈胞核和质弥漫一致强阳性。5%-10%肺腺癌阳性，通常为局灶性

CK5或CK5/6

非常有用，间皮瘤阳性率为75%-%,2%-20%肺腺癌呈局灶性阳性

WT-1

非常有用，75%-95%的间皮瘤呈核阳性。肺腺癌阴性

D2-40

非常有用，90%-%的间皮瘤沿细胞膜阳性表达，15%的肺腺癌局灶阳性

肺腺癌

MOC-31

非常有用，90%-%的肺腺癌阳性，2%-10%的间皮瘤局灶阳性

BG8

非常有用，90%-%的肺腺癌阳性，3%-7%的间皮瘤局灶阳性

CEA(单克隆)

非常有用，80%-%的肺腺癌阳性，5%的间皮瘤局灶阳性

B72.3

非常有用，75%-85%的肺腺癌呈阳性，间皮瘤很少表达

Ber-EP4

非常有用，95%-%的肺腺癌强阳性，最高20%的间皮瘤局灶阳性

TTF-1

非常有用，75%-85%的肺腺癌呈核阳性，间皮瘤不表达

NapsinA

非常有用，80%-90%的肺腺癌呈胞质表达，间皮瘤不表达

表4：肺鳞癌与胸膜上皮样恶性间皮瘤鉴别诊断的免疫组化标志物

标志物

应用

上皮样间皮瘤

Calretinin

有一定作用，实际上所有的间皮瘤都呈胞核和质弥漫强阳性，约40%的肺鳞癌阳性，通常呈局灶性

CK5或CK5/6

无用，75%-%间皮瘤阳性，%肺鳞癌阳性

WT-1

非常有用，高达95%的间皮瘤呈核阳性。肺鳞癌阴性

D2-40

无用，90%-%的间皮瘤阳性，50%的肺鳞癌阳性

肺鳞癌

MOC-31

非常有用，97%-%的肺鳞癌阳性，2%-10%的间皮瘤呈局灶性表达

BG8

非常有用，80%的肺鳞癌阳性，3%-7%的间皮瘤呈局灶性表达

Ber-EP4

有用，85%-%的肺鳞癌阳性，高达20%的间皮瘤呈局灶性阳性

P63/p40

非常有用，90%的肺鳞癌胞核呈弥漫性强阳性，7%的间皮瘤表达，且通常为局灶性

DSG3

非常有用，85%-90%的肺鳞癌表达

MOC-31

非常有用，97%-%的肺鳞癌阳性，2%-10%间皮瘤呈局灶性表达

CK5或CK5/6

无用，%的肺鳞癌阳性，75%-%的间皮瘤阳性

4.肺LCC的诊断和鉴别诊断

LCC是一类未分化的NSCLC,缺乏小细胞癌，腺癌或鳞癌分化的细胞和结构特征。根据定义，LCC是一类排他性诊断，指的是除外小细胞癌、腺癌、鳞癌之后的排除性诊断。随着免疫标志物的广泛应用，LCC可根据免疫表型进一步分类。

利用抗体组合包括腺癌标志物（如TTF-1、NapsinA、CK7）、鳞癌标志物（如p40、p63、CK5/6、DSG-3、CK(34βE12)和神经内分泌标志物（如CgA、Syn、CD56）可以将LCC进一步分为4种类型：60%-70%为低分化腺癌，10%-20%为低分化鳞癌，5%OLCNEC、其余为不表达任何标记的未分化癌（非特指类型的LCC）。可见大部分LCC实际上是低分化实体性腺癌，但由于黏液染色的敏感度太低（30%），有时该类腺癌可能不能满足WHO和肺腺癌多学科分类对于实体性腺癌的诊断标准，即2个高倍视野中每个视野至少有5个肿瘤细胞经黏液染然证实胞质内含黏液。5.对于NSCLC免疫组化结果的解释

通常认为，肺鳞癌不表达腺癌标志物（TTF-1、NapsinA）、在肺鳞癌中，TTF-1、NapsinA被错误判读为阳性结果可能有如下原因：将陷入癌巢内的反应性II型肺泡上皮细胞误认为肿瘤细胞；将丧失TTF-1和NapsinA表达的差分化实体性腺癌诊断为差分化鳞癌；部分肺鳞癌可能含有少量的腺癌成分致使局灶腺癌分化的区域表达TTF-1；肺泡内的巨噬细胞常表达NapsinA以及抗体的特异度和效价等。

综上所述，肺鳞癌不表达腺癌标志物（TTF-1、NapsinA），但腺癌可不同程度的表达鳞癌标志物（CK5/6、p63），特别是部分差分化实体性腺癌，TTF-1和NapsinA常不表达或呈低表达，对于这部分肿瘤在判断CK5/6和p63表达时应提高警惕，只有当肿瘤细胞呈CK5/6和p63弥漫性强烈（50%)表达时才能认为是阳性结果。对于TTF-1、NapsinA、CK5/6、p63均不表达的差分化NSCLC，仍不能轻易排除肺腺癌的诊断，可以酌情考虑选择一些特异性稍差的抗体，如CK7呈弥漫一致性强表达，仍应谨慎考虑肺腺癌的诊断。6.NSCLC个体化治疗的免疫标志物

a.EGFR突变的免疫组化检测美国NCCN指南以及我国专家组共识明确指出，应用EGFR-酪氨酸受体阻滞剂治疗进展期NSCLC之前应对EGFR突变状态进行检测，以便筛选EGFR-TKI治疗的最适宜对象。EGFR最常见（90%）的突变类型为外显子19的框内缺失突变（de-IE-A)和外显子21的点突变（LR)。

免疫组化染色评分标准通常按照细胞质和（或）细胞膜染色强度以及阳性细胞数量进行；≦10%的肿瘤细胞无或仅呈微弱着色为0分；10%的肿瘤细胞呈弱着色为1分；肿瘤细胞呈中度着色为2分；肿瘤细胞呈强着色为3分。结果判断标准。0分为阴性，1-3分为阳必。一般认为EGFR突变特异性抗体的特异度较高，但敏感度较差，其中检测LR的敏感度明显高于de-IE-A，这与外显子19和21存在其他少见突变类型所致的编码蛋白的构象差异有关。对于免疫组化检测阴性的病例，应警惕假阴性结果以及其他少见突变类型，需应用直接基因测序或PCR的方法进一步检测。免疫组化染色评分与EGFR-TKI疗效：一般认为评分为3的可直接使用EGFR-TKI治疗，而评分为0-2分需进一步应用分子学方法检测EGFR基因突变。b.ALK融合蛋白的免疫组化检测ALK融合基因目前已被定义为NSCLC，特别是肺腺癌的一种独特分子亚型。NSCLC患者使用ALK-TKI治疗前应检测ALK融合基因或ALK融合蛋白。应用免疫组化检测ALK融合蛋白表达的抗体主要有D5F3、5A4，其他克隆号如用于检测间变性大细胞淋巴瘤和炎性肌纤维母细胞肿瘤的ALK1和SP-8等，不适合用于检测EML4-ALK融合蛋白。c.免疫组化染色判断为阳性细胞数5%的肿瘤细胞呈细胞质染色，根据肿瘤细胞染色强度评分：无细胞染色为0分；微弱胞质染色为1分；中度胞质染色为2分；强胞质颗粒状染色为3分；按照上述判断标准，D5F3和5A4抗体的敏感性和特异性分别为%和95%-99%,其中免疫组化强阳性染色3分与FISH检测结果具有高度一致性（达98%）。

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