研究背景

年全球癌症统计数据显示，肺癌是全球发病率和死亡率最高的癌症。非小细胞肺癌(Non-small-celllungcancer,NSCLC)约占所有肺癌的80%-85%，腺癌和鳞状细胞癌是NSCLC的主要组织学亚型。在临床早期诊断中，60%以上的肺癌患者就诊时，已是局部晚期或发生了转移。近年来，对于晚期的NSCLC患者，分子靶向治疗和免疫治疗等多种治疗方法的逐渐进入使临床疗效不断提高。然而，已使用的分子靶向治疗或免疫治疗仅限于一小部分发生基因突变的晚期NSCLC患者。因此，铂类化疗药物仍是绝大多数NSCLC患者最广泛使用的化疗药物，包括基因突变进行了靶向治疗但失败的患者，以及I到IIIa期手术完全切除的患者。故而，尽管铂类药物存在化疗耐药性以及治疗失败的可能，但仍在广泛使用。在过去的三十年里，人们进行了大量的研究，探索肿瘤细胞顺铂耐药的机制。虽然在一定程度从分子水平解释了顺铂耐药的机制，但顺铂耐药是多因素导致的，目前已知的耐药机制在相关临床研究中并没有达到预期的效果，对非小细胞肺癌患者的无瘤生存期或总生存期几乎没有影响。此外，在临床上，肿瘤细胞一旦出现顺铂耐药，就会恶性发展，并对不同的化疗药物产生不同的药理机制的多药耐药，发生远处转移、复发，最终导致治疗失败。因此，迫切需要继续探索非小细胞肺癌化疗耐药性的新机制。研究路线研究内容

1、ZNF介导NSCLC的化疗耐药性

作者研究发现，顺铂、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛和培美曲塞在A/DDP（人肺腺癌耐顺铂株）细胞上的IC50明显高于其祖细胞A。由于诱导线粒体凋亡是顺铂抗肿瘤活性的主要机制之一，作者比较了顺铂处理A/DDP细胞和A细胞后线粒体功能的变化。结果表明，顺铂对A/DDP细胞线粒体功能的影响小于A细胞。H/DDP、H/DDP、H/DDP、H/DDP等细胞结果一致。由于A细胞广泛用于肺癌的科学研究，作者使用基因芯片对A和A/DDP细胞进行了潜在的化疗抵抗差异基因筛查。

将基因芯片中差异大于3倍的基因与已发表的甲基化芯片数据整合后发现，与A细胞相比，A/DDP细胞中有77个启动子低甲基化且表达上调的基因，有63个启动子高甲基化且表达下调的基因。对个基因进行RT-PCR验证，结果表明，A/DDP细胞与A相比，有15个启动子低甲基化且表达上调基因以及25个启动子高甲基化且表达下调的基因与芯片结果一致。在15个上调基因中，由于ZNF在A细胞中的表达可以忽略不计，而在A/DDP细胞中表达较高，故而作者选择ZNF作为候选的耐药基因进行后续研究。Westernblotting检测结果表明，ZNF在A/DDP、H/DDP和H/DDP细胞中的表达明显高于相应的祖细胞；ZNF在H和H细胞中内源性过表达；ZNF的表达在H/DDP与H细胞、H/DDP与H细胞间无显著差异。这一发现提示ZNF可能介导了NSCLC的化疗耐药性，而非SCLC。BSP检测了5-azacitidine和belinostat分别或联合处理A、H和H细胞后ZNF的表达变化，表明ZNF的表达受启动子甲基化的调控。接下来，作者利用重组慢病毒载体将ZNF在A细胞中过表达或沉默，探究ZNF在NSCLC耐药中的作用。

使用LV5-ZNF将ZNF在A细胞中成功过表达，命名为A-ZNF；分别使用LV3-shZNF-、LV3-shZNF-、LV3-shZNF-和LV3-shZNF-可以将ZNF在A/DDP细胞中成功沉默，但由于LV3-shZNF-对ZNF的沉默效果最好，在随后的实验中作者使用了LV3-shZNF-转染的A/DDP细胞，并命名为A/DDP-shZNF。使用慢病毒对照载体LV5-ZNF-NC转染的A细胞（命名为：A-ZNF-NC）和慢病毒对照载体LV3-shZNF-NC转染的A/DDP细胞(命名为：A/DDP-shZNF-NC)作为对照。顺铂、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛、培美曲塞在A-ZNF和A/DDP-shZNF-NC细胞上的IC50显著高于A-ZNF-NC和A/DDP-shZNF细胞。顺铂诱导A-ZNF和A/DDP-shZNF-NC的细胞凋亡明显低于A-ZNF-NC和A/DDP-shZNF，说明ZNF介导了NSCLC的化疗耐药性，这在接下来的皮下肿瘤异种移植模型中也得到了证实。用顺铂处理后，相对于皮下注射A-ZNF和A/DDP-shZNF-NC细胞的异种移植模型，皮下注射A-ZNF-NC和A/DDP-shZNF细胞的异种移植模型的肿瘤组织在肿瘤重量和体积方面显著缩小。在A/DDP细胞中使用LV3-shZNF-将ZNF沉默，也得到了同样的结果，表明LV3-shZNF-和LV3-shZNF-对A/DDP细胞中ZNF具有特异性沉默作用，本研究未观察到LV3-shZNF的脱靶效应。

2、ZNF促进肿瘤细胞的侵袭性生长且与NSCLC患者不良预后有关

临床上，肿瘤细胞一旦获得化疗耐药性，病情就会向恶性发展。作者接下来比较耐药细胞和化疗敏感细胞的生物学特性(A-ZNFvsA-ZNF-NC和A/DDP-shZNF-NCvsA/DDP-shZNF)。Transwell检测结果表明，耐药细胞相对于化疗敏感细胞侵袭能力明显增强(侵袭细胞数:.33±14.70vs.67±3.40,P0.01和.00±7.87vs95.33±8.99,P0.)。伤口愈合实验表明，耐药细胞的迁移率明显高于化疗敏感细胞(迁移率分别为47.63±2.14%vs12.84±1.03%，P0.和46.64±0.92%vs8.64±0.99%，P0.)。失巢凋亡抗性实验表明,耐药细胞的集落形成数目明显高于化疗敏感细胞(细胞集落数:11.00±1.41vs4.67±0.94,P0.01和12.00±0.82vs4.33±1.25,P0.01)，耐药细胞的抗失巢凋亡能力明显强于化疗敏感细胞(细胞凋亡率:4.79±1.15%vs18.97±0.64%,P0.vs11.78和5.12±0.21%vs11.78±1.57%,P0.01)。

为了评估ZNF在肺癌中的潜在作用，作者在正常人体组织(